Protective effect of milk against dental demineralization: understanding the mechanisms / Efeito protetor do leite contra a desmineralização dentária: compreensão dos mecanismos

This study aimed to answer the following questions: 1) does whole fluoridated milk protect more against enamel and dentin erosion than fat-free fluoridated milk? 2) does the protective effect of fluoridated milk against erosion follow a dose-response relationship? 3) is the treatment with whole or fat-free fluoridated milk before the first erosive challenge more protective against enamel and dentin erosion? 4) does the fat content of milk change the proteomic profile of the acquired enamel pellicle (AEP)? This study was divided into 2 parts. The first part analyzed in vitro the effect of milk against dental erosion, considering three factors: type of bovine milk (whole/fat-free), presence of different fluoride concentrations (0- 10.0 ppm) and time of application (before/after erosive challenge). Bovine enamel (n=15/group) and root dentin (n=12/group) specimens were submitted to the following treatments: 0.9% NaCl solution (negative control)( after first erosive challenge); whole milk with 0, 2.5, 5.0, 10.0 ppm F; fat-free milk with 0, 2.5, 5.0, 10.0 ppm F; 0.05% NaF solution (positive control) (before or after first erosive challenge). Specimens were submitted to demineralization - remineralization regimes, 4 times/ day, for 5 days. The response variables were enamel and dentin loss, evaluated by profilometry (µm). Data were analyzed using Kruskal­Wallis/Dunn's test (p<0.05). The presence of fluoride, especially at 10 ppm, was the most important factor in reducing dental erosion. The second part detected changes in protein profile of AEP formed in vivo after rinsing with whole milk, fat-free milk or water. Nine subjects with good oral conditions participated. The AEP was formed in the morning, for 120 min, after prophylaxis with pumice. In sequence, the volunteers rinsed with 10 mL of whole milk, fat-free milk or deionized water for 30 s, following a blind, crossover protocol. After 60 min, the AEP was collected with filter paper soaked in 3% citric acid and processed for analysis by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (LCESI- MS/MS). The obtained MS/MS spectra were searched against human protein database (SWISS­PROT). The proteomic data related to protein quantification were analyzed using the PLGS software. A total of 260 proteins were successfully identified in the AEP samples collected in all groups. Forty-nine were common to the 3 groups, while 72, 62 and 49 were specific for groups treated with whole milk, fat-free milk and water, respectively. Some were typical components of the AEP, such as Cystatin-B, Lysozyme C, Histatin-1, Statherin and Lactotransferrin. Other proteins are not commonly described as part of the AEP but could act in the defense of the organism against pathogens. Distinct proteomic profiles were found in the AEP after rinsing with whole or fat-free milk, which could have an impact in bacterial adhesion and tooth dissolution. The use of fat-free milk could favorably modulate the adhesion of bacteria in the AEP and the biofilm formation in comparison to whole milk.(AU)

Este estudo objetivou responder as seguintes questões: 1) o leite integral fluoretado protege mais contra a erosão do esmalte e dentina do que o leite fluoretado desnatado? 2) o efeito protetor do leite fluoretado segue um padrão dose-resposta? 3) o tratamento com leite integral ou leite desnatado fluoretado antes do primeiro desafio erosivo protege mais contra a erosão do esmalte e dentina? 4) o leite contendo gordura altera o perfil proteico da película adquirida do esmalte (PAE)? O estudo foi dividido em 2 partes. Na primeira parte foi realizado um estudo in vitro, considerando três fatores: tipo de leite bovino (integral/ desnatado), diferentes concentrações de fluoreto e tempo de aplicação (antes/após desafio erosivo). Os espécimes de esmalte bovino (n=15 /grupo) e dentina radicular (n=12 /grupo) foram submetidos aos seguintes tratamentos: solução de NaCl a 0,9% (controle negativo)(após o desafio erosivo); Leite integral com 0, 2,5, 5,0, 10,0 ppm F Leite desnatado com 0, 2,5, 5,0, 10,0 ppm F 0,05% de solução de NaF (controle positivo) (antes ou após o primeiro desafio erosivo). Os espécimes foram submetidos a regimes de desmineralização e remineralização, 4 vezes/dia, durante 5 dias. As variáveis de resposta foram perda de esmalte e dentina, avaliadas por perfilometria (µm). Os dados foram analisados usando o teste de Kruskal-Wallis / Dunn (p <0,05). A presença de fluoreto, especialmente na concentração de 10 ppm, demonstrou ser o fator mais importante na redução da erosão dentária. A parte II do estudo detectou alterações no perfil proteico da PAE formada in vivo após bochecho com leite integral, leite desnatado ou água. Nove indivíduos com boas condições de saúde bucal participaram. A PAE foi formada pela manhã, durante 120 minutos, após profilaxia com pedra-pomes. Em seguida, os voluntários bochecharam com 10 mL de leite integral, leite desnatado ou água deionizada durante 30 s, seguindo um protocolo cego e cruzado. Após 60 min, a película foi coletada com papel de filtro embebido em ácido cítrico a 3% e processada para análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas com ionização por eletrospray (LC-ESI-MS / MS). Os espectros MS/MS obtidos foram confrontados com bases de dados de proteínas humanas (SWISSPROT). Os dados proteômicos relacionados à quantificação de proteínas foram analisados usando o software PLGS. Um total de 260 proteínas foi identificado nas amostras de PAE coletadas em todos os grupos. Quarenta e nove eram comuns aos 3 grupos, enquanto 72, 62 e 49 eram específicas para grupos tratados com leite integral, leite desnatado e água, respectivamente. Algumas proteínas encontradas são típicas da PAE, como Cistatina-B, Lisozima C, Histatina-1, Estaterina e Lactotransferrina. Outras proteínas não são comumente descritas como parte da PAE, mas podem atuar na defesa do organismo contra patógenos. Perfis proteômicos distintos foram encontrados na PAE após o bochecho com leite integral ou desnatado, o que poderia ter um impacto na adesão bacteriana e na dissolução dentária. O uso de leite desnatado pode modular favoravelmente a adesão de bactérias na PAE e a formação do biofilme em comparação com o leite integral.(AU)

Proteomics of acquired enamel pellicle in volunteers with gastroesophageal reflux with dental erosion or not / Proteoma da película adquirida em voluntários com refluxo gastresofágico com erosão dentária ou não

This study compared the protein profile of the acquired enamel pellicle (PAE) in 1) volunteers with gastroesophageal reflux disease (GERD) and dental erosion (BEWE ≥ 9 or grade 3 in the upper anterior sextant, all incisors affected; GE group); 2) volunteers with GERD without dental erosion (BEWE=0; GNE group) and 3) control volunteers (without GERD and dental erosion; BEWE = 0; C group). Twenty four subjects (8 in each group) participated. After dental prophylaxis, the AEP was allowed to form during 120 min and was then collected from the vestibular surface of the upper and lower teeth, with filter paper pre-soaked in 3% citric acid. After protein extraction, the samples were submitted to reverse phase liquid chromatography coupled to mass spectrometry (nLC-ESI-MS/MS). Label-free proteomic quantification was performed using Protein Lynx Global Service (PLGS) software. In total, 458 proteins were identified. Seventy-six proteins were common to all the groups. The proteomic profile of the AEP was quite different among the distinct groups. The numbers of proteins exclusively found in the C, GE and GNE groups were 113, 110 and 81, respectively. Most of the proteins exclusively identified in the C and GNE groups bind metals, while those in the GE group are mainly membrane proteins. Many proteins were found exclusively in the reflux groups. Heat-shock proteins were not found in GE. Histatins and Histones were not found in GNE, while Serine/threonine-protein kinases were only identified in GNE. In the quantitative analysis, when the GNE group was compared with the GE group, the proteins with the highest decreases were Lysozyme C, Antileukoproteinase, Cathepsin G, Neutrophil defensins and Basic salivary proline-rich proteins, while those with the highest increases were subunits of Hemoglobin, Albumin and isoforms of Cystatin. Profound alterations in the proteomic profile of the AEP were seen in GNE compared with GE volunteers, which might play a role in the resistance to dental erosion seen in the first. (AU)

Este estudo comparou o perfil proteico da película adquirida do esmalte adquirida (PAE) em 1) voluntários com doença de refluxo gastroesofágico (DRGE) e erosão dentária (BEWE ≥ 9 ou grau 3 no sextante anterior superior, todos os incisivos afetados; 2) voluntários com DRGE sem erosão dentária (BEWE = 0; grupo GNE) e 3) voluntários de controle (sem DRGE e erosão dentária, BEWE = 0; grupo C). Participaram vinte e quatro indivíduos (8 em cada grupo). Após a profilaxia dentária, permitiu-se que a PAE se formasse durante 120 minutos e foi então coletada a partir da superfície vestibular dos dentes superiores e inferiores, com papel de filtro previamente embebido em ácido cítrico a 3%. Após a extração da proteína, as amostras foram submetidas a cromatografia líquida de fase reversa acoplada a espectrometria de massa (nLC-ESI-MS / MS). A quantificação proteômica livre de marcadores foi realizada utilizando o software de Protein Lynx Global Service (PLGS). No total, foram identificadas 458 proteínas. Setenta e seis proteínas foram comuns a todos os grupos. O perfil proteômico da AEP foi bastante diferente entre os grupos distintos. O número de proteínas encontradas exclusivamente nos grupos C, GERD com erosão e GERD sem erosão foi de 113, 110 e 81, respectivamente. A maioria das proteínas exclusivamente identificadas nos grupos C e GERD sem erosão se liga a metais, enquanto que as do grupo GERD com erosão são principalmente proteínas de membrana. Muitas proteínas foram encontradas exclusivamente nos grupos de refluxo. As proteínas Heat-shock não foram encontradas no GERD com erosão. Histatins e Histones não foram encontradas no GERD com erosão, enquanto Serine/threonine-protein kinases foram identificadas apenas no GERD sem erosão. Na análise quantitativa, quando o grupo GERD sem erosão foi comparado com o grupo GERD com erosão, as proteínas com as maiores diminuições foram Lysozyme C, Antileukoproteinase, Cathepsin G, Neutrophil defensins and Basic salivary prolinerich proteins enquanto aquelas com os maiores aumentos foram subunidades de Hemoglobin, Albumin e isoformas de Cystatin. Maiores alterações no perfil proteômico da PAE foram observadas no GERD sem erosão em comparação com os voluntários GERD com erosão, o que pode ter um papel na resistência à erosão dentária observada anteriormente. (AU)

Análise proteômica da película adquirida formada sobre resinas compostas experimentais contendo ou não carga e/ou inibidores de proteases: estudo in situ / Proteomic analysis of acquired pellicle formed on experimental composite resins containing or not filler and/or protease inhibitors: study in situ

Na cavidade oral, qualquer superfície exposta é propensa à formação da película adquirida (PA), sendo considerada um filme orgânico, livre de bactérias que se forma in vivo como resultado da adsorção seletiva de proteínas e glicoproteínas salivares às superfícies solidas que estão expostas ao meio bucal. O objetivo deste trabalho será avaliar a influência da adição ou não de carga (vidro de bário alumina silicato e sílica) e/ou de inibidores de proteases (EGCG ou CHX) a resinas compostas experimentais no perfil proteico da PA formada sobre estes espécimes, utilizando estratégias proteômicas quantitativas livres de marcadores. Foram preparadas 324 amostras de esmalte bovino (6x6x2mm), foi feita uma cavidade no centro de 4x4mm, a qual foi preenchida com resinas experimentais. As amostras foram divididas em 6 grupos de 54 espécimes cada, de acordo com os grupos experimentais: Sem carga, sem inibidor (NF-NI); carga, sem inibidor (F-NI); sem carga e CHX (NF-CHX); carga e CHX (F-CHX); sem carga e EGCG (NF-EGCG); carga e EGCG (F-EGCG). Nove adultos jovens de ambos os gêneros paticiparam, usando um aparelho mandibular removível (BISPM - Bauru in situpellicle model) com duas amostras de cada grupo. O experimento foi conduzido por 9 dias consecutivos, durante a manhã por 120 minutos. A PA foi obtida através da ajuda do papel filtro de eletrotodo, umidecido em 3% de ácido cítrico. A película coletada, foi processada por LC-ESI-MS/MS. Os espectros MS/MS obtidos foram confrontados com bases de dados de proteínas humanas (SWISS-PROT). A quantificação livre de marcadores foi feita utilizando o software PLGS. A diferença de expressão entre os grupos foi expressa como p<0.05 para as proteínas down-regulated e 1-p>0.95 para as proteínas up-regulated. Um total de 140 proteínas foram identificadas na PA. Destas, 16 foram encontradas em comum em todos os grupos, dentre elas muitas proteínas típicas da PA, tais como, duas isoformas de Basic salivary proline-rich protein, Cystatin-S, Cystatin-AS, Cystatin-SN, Histatin-1, Ig alpha-1 chain C region, Lysozyme C, Mucin-7, Proline-rich protein 4, Protein S100- A9, Salivary acidic proline-rich phosphoprotein ½, Statherin e Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B. O número total de proteínas identificadas em cada grupo foi 31, 51, 18, 38, 106 and 54 para NF-NI, F-NI, NF-CHX, F-CHX, NF-EGCG e F-EGCG, respectivamente. A respectiva quantidade de proteínas exclusivas de cada grupo foi 6, 14, 1, 6, 51 e 5. A maioria das proteínas que não são comumente descritas na PA e que tem funções distintas no organismos, estando envolvidas no metabolismo, sinalização celular, adesão celular, divisão celular, transporte, síntese proteica e degradação foram encontradas no grupo NF-EGCG. Estes resultados demonstram que houve uma diferença no perfil preteico da PA, devido à composição das resinas experimentais, além de oferecer informações importantes sobre o desenvolvimento de materiais restauradores com componentes que podem aumentar a proteção na cavidade oral.(AU)

In the oral cavity, any exposed surface is prone to the formation of the acquired pellicle (AP), an organic film, free of bacteria, which is formed in vivo as a result of the selective adsorption of salivary proteins and glycoproteins to the solid surfaces exposed to the oral environment. The objective of this work was to evaluate the influence of the addition or not of filler (Barium glass alumina silicate and silica) and/or protease inhibitors [epigallocatechin-3-gallate (EGCG) or chlorhexidine (CHX)] to experimental composite resins in the protein profile of the AP formed on these specimens, using quantitative label-free proteomic analysis. Three-hundred and twenty-four samples of bovine enamel (6x6x2mm) were prepared. A cavity (4x4mm) was made, filled with experimental resins and divided into 6 groups of 54 specimens each, according to the experimental groups: no filler, no inhibitor (NF-NI); filler, no inhibitor (F-NI); no filler plus CHX (NF-CHX); filler plus CHX (F-CHX); no filler plus EGCG (NF-EGCG); filler plus EGCG (F-EGCG). Nine young adults of both genders participated using a removable jaw appliance (BISPM - Bauru in situ pellicle model)) with 2 slabs of each group. The experiment was carried out in 9 consecutive days, during the morning for 120 minutes. The pellicle was obtained through the aid of electrodes filter paper moistened in 3% citric acid. The pellicles collected were processed for analysis by LC-ESI-MS/MS. The obtained MS/MS spectra were searched against human protein database (SWISS­PROT). The proteomic data related to protein quantification were analyzed using the PLGS software. Difference in expression among the groups was expressed as p<0.05 for down-regulated proteins and 1-p>0.95 for up-regulated proteins. A total of 140 proteins were identified in the AP. From these, 16 were found in all the groups, among which are many proteins typically found in the AP, such as two isoforms of Basic salivary proline-rich protein, Cystatin-S, Cystatin-AS, Cystatin-SN, Histatin-1, Ig alpha-1 chain C region, Lysozyme C, Mucin-7, Proline-rich protein 4, Protein S100-A9, Salivary acidic proline-rich phosphoprotein ½, Statherin and Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B. The total number of proteins identified in each group was 31, 51, 18, 38, 106 and 54 for NF-NI, F-NI, NF-CHX, F-CHX, NF-EGCG and F-EGCG, respectively. The respective amount of proteins exclusively in each group was 6, 14, 1, 6, 51 and 5. Most of the proteins that are not commonly described in the AP that have distinct functions in the organism, being involved in metabolism, cell signaling, cell adhesion, cell division, transport, protein synthesis and degradation were found most prominently in the NF-EGCG group. These results demonstrate that there was a difference in the protein profile of the AP due to the composition of the experimental resins, beyond offering important information on the development of restorative materials with components that can increase the protection in the oral cavity.(AU)

Alterações no perfil proteômico da película adquirida formada in vivo e em diferentes tempos, após exposição ao ácido clorídrico / Changes in the proteomic profile of acquired enamel pellicles formed in vivo for different times, after exposure to hydrochloric acid

A saliva é um importante meio de proteção contra danos ao esmalte e dentina, e é quando ela entra em contato com a superfície dentária, que ocorre uma adsorção seletiva de proteínas salivares, glicoproteínas e lipídeos. Esta adsorção forma um filme orgânico, que é isenta de bactérias, que quando formada sobre esmalte dentário é denominada de película adquirida do esmalte (PAE). A presença destas proteínas recobrindo os tecidos dentários auxilia na lubrificação, tem capacidades de tamponamento e de remineralização, tornando-se um importante fator de proteção contra erosão dentária. O objetivo deste trabalho foi detectar as alterações no perfil protéico na película adquirida do esmalte (PAE) formada in vivo, após a exposição ao ácido clorídrico. Os experimentos foram realizados em 12 dias consecutivos. Em cada dia, os voluntários (n=9), com idade entre 18 a 35 anos, não fumantes, e com um bom estado de saúde geral e bucal, eram submetidos a uma profilaxia dentária com pedra pomes. Depois de 3 min ou 120 min e após a formação PAE, os dentes eram isolados com rolos de algodão e submetidos a 3 procedimentos distintos, sendo um deles realizado a cada dia: aplicação de 50µL de ácido clorídrico (0,1 M, pH 1), ácido clorídrico (0,01 M, pH 2) ou água deionizada por 10 segundos. A aplicação foi feita, em todos os dentes dos arcos superiores e inferiores na face vestibular. Na sequência, a película foi removida com um papel de filtro umedecido em ácido cítrico a 3%. Este procedimento foi repetido por mais uma vez e foi feito um "pool' com os papeis de filtro obtidos dos 9 voluntários, para cada procedimento e tempo de formação (Água-3min, Água-2h, pH2-3min, pH2-2h, pH1-3min e pH1-2h). Após extração das proteínas, as mesmas foram submetidas à cromatografia líquida de fase reversa interligada a um espectrômetro de massas (nLC-ESI-MS/MS). Quantificação proteômica livre de marcadores foi feita utilizando o software (Protein Lynx Global Service software). Um total de 180 proteínas foram encontradas nas amostras de PAE. E o número de proteínas identificadas crescia conforme aumentou-se o seu tempo de formação da película. Somente 4 proteínas foram presentes em todos os grupos sendo estas isoforms de IgA, Serum albumin e Statherin. Um grande número proteínas foram identificadas como sendo únicas dos grupos tratados com HCl, depois de 2h de formação de película (~ 50 proteínas). Em conclusão as proteínas são resistentes a remoção por HCl, e tanto que Serum Albumin e Statherin, foram identificadas em películas formadas em tempos precoces. Para películas formadas no tempo de 120-min foram encontradas muitas proteínas que são resistentes a remoção por HCl. Este fato sugere um aumento da proteção contra ácidos intrínsecos conforme o tempo de formação de película, o que deverá ser avaliada em estudos futuros.(AU)

Saliva it is an important factor against enamel and dentin damages. When the saliva enter in contact with the dental surface, results in a selective adsorption of salivary proteins, glycoproteins and lipids. This adsorption formed an organic free-bacterial film, which when formed in the enamel, is denominated acquired enamel pellicle. The presence of this proteins covering the enamel tissues, has the function of lubrication, buffering and remineralization capabilities, making it an important factor against dental erosion. The objective of this study was detected changes in the protein profile of acquired enamel pellicles (AEP) formed in vivo for different times, after application of hydrochloric acid (HCl). The experimental was realized in 12 consecutive days. On each day, nine subjects, (aged 18 to 35 years, non-smokers, with good general and oral health) were submitted to dental prophylaxis with pumice. After 3 or 120 min, time of formation of the acquired pellicle, the teeth were isolated with cotton rolls and, submitted for a 3 different procedures, one procedure of each day, 50 µL of 0.1 M HCl (pH = 1.0), 0.01 M HCl (pH = 2.0) or deionized water were applied on the buccal surface of the teeth for 10 s. The application of HCl was in all teethes from the superior and lower arch, in vestibular surface. In sequence the AEP was collected using an electrode filter paper pre-soaked in 3% citric acid. This procedures was repeted for one more day. After protein extraction, the samples were submitted to reverse phase liquid chromatography coupled to mass spectrometry (nLC-ESI-MS/MS). Label-free quantification was performed (Protein Lynx Global Service software). A total of 180 proteins were successfully identified in the AEP samples. The number of identified proteins increased with the time of pellicle formation. Only 4 proteins were present in all the groups (isoforms of IgA, Serum albumin and Statherin). The greatest number of proteins identified uniquely in one of the groups was obtained for the groups treated with HCl after 2 h of pellicle formation (~ 50 proteins). Conclusion: Proteins resistant to removal by HCl, such as Serum Albumin and Statherin, were identified even in the short-term AEP. In addition, 120-min pellicle present many proteins that are resistant to removal by HCl. This suggests an increase in the protection against intrinsic acids along the time of pellicle formation, which should be evaluated in future studies.(AU)

Influência de tensoativos sobre o efeito protetor da película e interação com NaF no desenvolvimento da erosão dental / Influence of surfactant agents on acquired pellicle protector effect and sodium fluoride interaction during dental erosion development

A erosão dental é um processo multifatorial que envolve a desmineralização do esmalte/dentina pela ação química de ácidos extrínsecos ou intrínsecos. A película adquirida é um filme, livre de bactérias, que cobre os dentes e atua como barreira de difusão ou membrana permeável seletiva, prevenindo o contato direto de ácidos com a superfície dos dentes. Os dentifrícios, normalmente usados no controle do biofilme bucal, possuem agentes tensoativos, que podem influenciar na adsorção de proteínas salivares, e atuar diretamente na formação da película adquirida e na liberação de fluoretos para o meio bucal. Assim, verificou-se a ação destes agentes na formação e proteção da película adquirida, sua interação com fluoreto de sódio (NaF) no esmalte, e consequentemente sua interferência na proteção contra a erosão dental. Foram testados três tensoativos (Lauril Sulfato de Sódio - LSS, Tween 20 ­ T20 e Cocoamidopropil Betaína - CAPB), em duas concentrações (1,0% e 1,5%). A água foi utilizada como controle negativo. Amostras de esmalte bovino foram submetidas a um modelo de des/remineralização com ácido cítrico durante 5 dias, imersão em saliva humana para formação de película adquirida e em soluções com os tensoativos testados, associados ou não ao NaF (275 ppm). A solução de NaF foi utilizada como controle positivo. A análise da energia de superfície do esmalte foi determinada por goniometria e a formação de película adquirida quantificada por espectroscopia (FTIR). A erosão inicial foi determinada por microdureza no primeiro dia (mensurada após o primeiro ácido, após o tratamento e após o segundo ácido) e a perda de estrutura de esmalte foi definida por perfilometria ao final de cinco dias de ciclo. Ainda, foi quantificado o flúor solúvel em KOH adsorvido na superfície do esmalte com eletrodo específico. Os resultados de goniometria mostraram que apenas o LSS e o CAPB em ambas concentrações diminuíram o ângulo de contato entre a água e o esmalte. Quanto à quantificação da formação de película, não foi possível verificar diferença significante entre os grupos testados. Com relação à erosão, os dados de dureza mostraram que os tensoativos, independente da concentração, não interferiram no reendurecimento do esmalte, porém o LSS a 1% e 1,5% interferiu no potencial de proteção do NaF, e o T20 a 1% e 1,5% e o CAPB a 1,5% protegeram o esmalte, porém não foram superiores ao efeito do NaF. Já a análise perfilometria mostrou que o T20 a 1% resultou em menores valores de perda que a 1,5%, e ainda que o CAPB 1% e 1,5% foi capaz de proteger comparado ao controle negativo, no entanto nenhum agente associado ao NaF protegeu mais do que o controle positivo. Os dados da concentração de flúor KOH-solúvel indicaram que os tensoativos reduziram a adsorção do CaF2 ao esmalte. Conclui-se que os tensoativos testados reduziram o ângulo de contato da água com o esmalte (exceção do T20). O LSS reduziu o potencial protetor do NaF e da película na erosão inicial e nenhum agente testado interferiu na capacidade protetora do NaF contra a progressão do desgaste erosivo(AU)

Dental erosion can be defined as a multifactorial process that induces tooth dissolution by intrinsic or extrinsic acids. Acquired pellicle is a film, free from bacteria, that covers all tooth tissues, and acts as a selective membrane that prevents direct contact of the acids with enamel/dentin surface. Dentifrices, frequently used in the biofilm control, have some constituents, such as surfactant agents, which influence on the adsorption of salivary proteins, and may directly affect the formation of salivary pellicle and the fluoride release on oral environment. Thus, it was verified the influence of surfactants over the protective effect of the acquired pellicle, and on the interaction of fluoride with enamel. Three different surfactants were tested (Sodium Lauryl Sulphate - SLS, Tween 20 ­ T20 and Cocoamidopropyl Betaine - CAPB), in 2 different concentrations (1.0% and 1.5%). Water was used as negative control. Bovine enamel samples were selected and submitted to an in vitro des/remineralization model with citric acid during 5 days, immersion in human saliva for acquired pellicle formation and immersion in the surfactant solutions, associated or not with sodium fluoride (NaF ­ 275ppm). A NaF solution was used as positive control. The surface wettability was determined by contact angle between water and the enamel using a tensiometer, and the acquired enamel pellicle formation was assessed using a spectrophotometer (FTIR). Initial erosion was defined by microhardness at the first cycle day (measured after the first acid, after treatment and after the second acid), and the structure loss was determined by profilometry. The KOH-soluble fluoride was also quantified after the end of the cycle. The surface energy analysis showed that only SLS and CAPB in both concentrations decreased the contact angle between enamel and water. Regarding the proteins quantification, no differences were found between the groups. Concerning initial erosion, microhardness data showed that all surfactants, in both concentrations, did not interfered with enamel remineralization, but 1% and 1,5% SLS interfered on NaF protective effect. 1% and 1,5% T20 and 1,5%, CAPB despite presenting some protective effect against new acid challenge, did not promote the same protection as NaF. Profilometry results showed that the 1% T20 promoted lower surface loss than at 1.5%, while 1% and 1.5% CAPB protected enamel compared to negative control group. However, no agent associated with NaF showed higher protection than the positive control. KOH-soluble fluoride analysis showed that all surfactants reduced the CaF2 adsorption over enamel surface. It can be concluded that the surfactants tested reduced the enamel contact angle (except for T20). The SLS decreased the protective potential of NaF associated with the pellicle in initial erosion and no agent tested interfered with the protective effect of NaF on enamel erosive wear(AU)

Detecção de alterações na composição da película adquirida em função da sua localização na cavidade bucal: estudo proteômico / Detecção de alterações na composição da película adquirida em função da sua localização na cavidade bucal: estudo proteômicox

A película adquirida do esmalte (PAE) é um filme orgânico, livre de bactérias, formado in vivo como resultado da adsorção seletiva de proteínas salivares sobre a superfície do dente, contendo também glicoproteínas e lipídeos. A presença de proteínas na PAE forma uma interface protetora sobre a superfície do dente, participando em todos os eventos interfaciais que ocorrem na cavidade bucal. O objetivo deste trabalho foi detectar alterações no perfil proteico da PAE formada in vivo de acordo com a sua localização nos arcos dentários. Fizeram parte da pesquisa 9 voluntários, com idade entre 18 e 35 anos, não fumantes, com bom estado de saúde geral e bucal. A película adquirida foi formada no período da manhã, por 120 minutos, após profilaxia com pedra pomes. Películas formadas nas regiões anterior vestibular superior e inferior (ULALa; dentes 13-23 e 33-43), anterior palatina superior (UAPa; dentes 13-23), anterior lingual inferior (LALi; dentes 33-43), posterior vestibular superior e inferior (ULPLa; dentes 14-17, 24-27, 34-37 e 44-47), posterior palatina superior (UPPa; dentes 14-17 e 24-27) e posterior lingual inferior (LPLi; dentes 34-37 e 44-47) foram coletadas separadamente para análise. Após a sua formação, a película foi coletada em papel filtro embebido em ácido cítrico a 3% e processada para análise por LC-ESI-MS/MS. Os espectros MS/MS obtidos foram confrontados com bases de dados de proteínas humanas (SWISS PROT). A quantificação livre de marcadores foi feita utilizando o software PLGS. Um total de 363 proteínas foi encontrado, sendo 252 proteínas únicas de cada grupo e 25 proteínas comuns entre eles (como Protein S100-A8, Lysozyme C, Lactoferrin, Sthatherin, Ig alpha-2 chain C, ALB protein, Myeloperoxidase and Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B). Na análise quantitativa, nove comparações foram realizadas e muitas proteínas foram diferentemente expressas entre os grupos, demonstrando assim que a localização na cavidade bucal pode alterar a composição da película adquirida do esmalte. Foram encontradas tanto proteínas típicas da película quanto proteínas não anteriormente descritas na película, cuja função na película foi inferida com base na literatura. Em conclusão houve diferença na composição proteica da película adquirida de acordo com a localização dos arcos dentários. Esses dados devem ser levados em conta quando se pensa no potencial protetor da película adquirida contra a desmineralização dentária, uma vez que esses resultados fornecem informações importantes para a compreensão dos diferentes papeis protetores da AEP dependendo da sua localização nos arcos dentários.(AU)

The acquired enamel pellicle (AEP) is a bacteria-free organic film formed in vivo as a result of selective adsorption of salivary proteins on the surface of the tooth. It also contains glycoproteins and lipids. The presence of proteins in the AEP forms a protective interface on the tooth surface that participates in the interfacial events that occur in the oral cavity. The objective of this study was to detect changes in the protein profile of the AEP formed in vivo according to its location in the dental arches. Nine volunteers, aged 18 to 35 years, non-smokers, with good general and oral health participated in the study. The acquired pellicle was formed in the morning, for 120 minutes, after prophylaxis with pumice. Pellicle formed at upper and lower anterior labial (ULALa; teeth 13-23 and 33-43), upper anterior palatal (UAPa; teeth 13-23), lower anterior lingual (LALi; teeth 33-43), upper and lower posterior labial (ULPLa; teeth 14-17 24 to 27, 34 to 37 and 44 to 47), upper posterior palatal (UPPa; teeth 14 to 17 and 24 to 27) and lower posterior lingual (LPLi; teeth 34 to 37 and 44 to 47) regions was collected separately for analysis. After its formation, the pellicle was collected with filter paper soaked in 3% citric acid and processed for analysis by LC-ESI-MS/MS. The MS/MS spectra obtained were compared with human protein databases (SWISS PROT). Label-free quantification was done using the PLGs software. A total of 363 proteins were found, of which 252 are unique proteins for one of the regions, while 25 proteins care to all of them, including Protein S100-A8, Lysozyme C, Lactoferrin, Sthatherin, Ig alpha-2 chain C, ALB protein, Myeloperoxidase and Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B. In the quantitative analysis, 9 comparisons were made and many proteins were differently expressed among the groups, thus demonstrating that the location in the dental arches can change the composition of the AEP. Some proteins not previously found in the AEP were identified and their function in the AEP was inferred from the literature. In conclusion, the composition of the AEP changes as a function of its location in the dental arches. These data should be taken into account when we think about the protective potential of the acquired pellicle against tooth demineralization and provide important insights for understanding the differential protective roles of the AEP as a function of its location in the dental arches.(AU)

Determinação da mudança na composição da película adquirida formada sobre esmalte e dentina após exposição ácida: estudo proteômico / Determination of change in the composition of the acquired pellicle formed on enamel and dentin after acid exposure: proteomic study

O objetivo deste trabalho foi analisar as mudanças no perfil protéico em películas adquiridas formadas in situ, em diferentes tempos, sobre o esmalte e sobre a dentina humana após a exposição a dois tipos de ácido: lático e cítrico. Foram utilizados 162 blocos de esmalte e 162 blocos de dentina humana (3X3 mm). Os experimentos foram realizados em três dias consecutivos. Em cada dia, os voluntários (n=9) utilizavam um dispositivo mandibular contendo 6 blocos de esmalte e 6 blocos de dentina. Na sequência, os voluntários permaneceram com o dispositivo na cavidade bucal por 10 ou 120 minutos para formação de película adquirida. Os blocos foram então imersos em ácido cítrico (1%, pH 2,5) ou ácido lático (0,1 M pH 4,8) ou água deionizada por 20 segundos. Na sequência, a película foi removida com um papel de filtro umedecido em ácido cítrico a 3%. Este procedimento foi repetido por mais dois dias adicionais e foi confeccionado um pool com os papeis de filtro obtidos dos 9 voluntários, para cada tipo de substrato, tempo de coleta e meio de imersão. Após extração das proteínas, as mesmas foram submetidas à cromatografia líquida de fase reversa interligada a um espectrômetro de massas (nLC-ESI-MS/MS). Os dados obtidos de MS/MS foram processados e submetidos conjuntamente ao programa SEQUEST [Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Scientific)]. As buscas foram feitas utilizando-se os bancos de dados SWISS-PROT e TrEMBL. Para o esmalte, a taxa de identificação de proteínas foi baixa (13 proteínas no total). Já para a dentina, a taxa de identificação de proteínas foi maior (223 proteínas no total), sendo que a exposição ao ácido cítrico reduziu dramaticamente o número de proteínas identificado, o que não aconteceu para o ácido lático. Proteínas ácido-resistentes foram identificadas tanto para o esmalte quanto para a dentina, destacando-se as queratinas e as mucinas, respectivamente. Estas proteínas, ou os peptídeos oriundos delas responsáveis pelo efeito protetor...

The purpose of this work was to analyze changes in protein profile in the acquired pellicle formed on enamel and dentine at different times in situ after exposure to lactic and citric acids. Enamel (n=162) and dentin (n=162) blocks (3X3 mm) were be used. The experiments were conducted on three consecutive days. Each day, volunteers (n = 9) used a mandibular device containing 6 blocks of enamel and 6 of human dentin. After the volunteers remained with the device in the oral cavity for 10 or 120 minutes in order to allow the formation of the acquired pellicle, the blocks were immersed in citric acid (1%, pH 2.5) or lactic acid (0.1 M, pH 4,8) or deionized water for 20 seconds. Following, the pellicle was collected with an electrode filter paper soaked in 3% citric acid. This procedure was repeated for two additional days and 'pools' with the filter papers obtained from the 9 volunteers for each type of substrate, sampling time and type of acid were made. After extraction, proteins were subjected to reverse phase liquid chromatography coupled to mass spectrometry (nLC-ESI-MS/MS). MS/MS data were processed and submitted to SEQUEST software [Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Scientific)]. Searches were done using SWISS-PROT and TrEMBL databases. The rate of protein identification was low for enamel (13 proteins in total). As for dentin, the rte of protein identification was higher (223 proteins in total). Exposure to citric acid dramatically reduced the number of identified proteins, what did not occur for lactic acid. Acid-resistant proteins, especially keratins and mucins were identified for enamel and dentin, respectively. These proteins, or the peptides originated from them that are responsible for the protective effect, are candidates to be used for the enrichment of dental products, aiming to prevent dental caries and erosion.

Determinação da composição da película adquirida formada sobre o esmalte humano in vivo e da sua modificação após estimulação química e mecânica do fluxo salivar: estudo proteômico / Characterization of the acquired pellicle formed in vivo over human enamel and its modification after mechanical and chemical salivary flow stimulation: proteomic study

Determinação da composição da Película Adquirida formada sobre o esmalte humano in vivo e da sua modificação após estimulação química e mecânica do fluxo salivar: estudo proteômico. Todas as superfícies sólidas expostas na cavidade bucal são cobertas por uma camada proteinácea denominada película adquirida do esmalte. Trata-se de um filme orgânico, livre de bactérias, que recobre os tecidos dentários e é composto basicamente por proteínas. Diversos trabalhos têm se concentrado na caracterização e no impacto protetor da película adquirida formada sobre a superfície do esmalte. Porém tanto para a película adquirida formada sobre o esmalte in situ quanto in vivo, as considerações sobre o tipo de saliva que contribuiu para sua formação são bastante limitadas, senão inexistentes. Com base nisto, o objetivo deste estudo foi comparar o perfil proteico em películas adquiridas formadas in vivo sobre o esmalte humano em condições de repouso, bem como analisar as películas formadas após estimulação salivar mecânica e química, através de espectrometria de massa. Os experimentos foram realizados por três dias consecutivos, seguindo um delineamento cruzado. Em cada dia, os voluntários (n=9) receberam uma meticulosa profilaxia dentária. Em seguida, aguardaram por duas horas para que a película adquirida fosse formada naturalmente sobre o esmalte (saliva não estimulada Grupo 1, controle). Após o período em questão, cada quadrante da boca foi enxaguado, seco e a película adquirida foi então coletada com auxílio de um papel filtro de eletrodos (electrode wick filter paper, Bio-Rad) embebido em ácido cítrico 3%. Os procedimentos descritos acima foramrepetidos em outros dois dias consecutivos para cada voluntário, sendo que em um dos dias os voluntários estimularam o fluxo salivar mecanicamente (saliva com estimulação mecânica Grupo 2), através da mastigação de Parafilm®, durante o mesmo período de tempo. Em outro dia, o fluxo salivar foi estimulado através de...

All solid surfaces exposed in the oral cavity are covered by a closely adherent protein film termed the acquired enamel pellicle (AEP). It is an organic, bacteria-free film that overlies the hard dental tissues and is basically composed by glycoproteins and proteins. Recently, many studies have focused on the characterization and the protector impact of the acquired pellicle formed over the enamel surface. However either for the in situ or in vivo formed AEP, information regarding the type of saliva which has contributed for its formation is quite limited, or even inexistent. Based on this, the aim of the present study was to compare the protein profile of acquired pellicles formed in vivo over the human enamel surfaces under resting condition and also to analyze the protein profile of the pellicles formed after mechanical and chemical salivary flow stimulation using mass spectrometry. The experiments were performed on three consecutive days, following a crossover design. On each day, the volunteers (n=9) received a meticulous dental prophylaxis and then waited for two hours to allow the AEP formation (non stimulated saliva - group 1). After the time span, each quadrant of the mouth was rinsed with water, dried by air spray and then the collection of the AEP was carried out using a filter paper (electrode wick filter paper, Bio-Rad) presoaked in 3% citric acid The procedures described above were repeated on two other consecutive days for each volunteer. However, in one day their salivary flow was mechanically stimulated (mechanical stimulation Group 2) by chewing on Parafilm® during the same period of time. In another day, the salivary flow was chemically stimulated (Chemical stimulation Group 3) by 2% citric acid drops on each side of the tongue, once per minute, for the same period of time. For each group, a pool with the wick filters from all 9 volunteers was made. After the extraction and digestion of the proteins from the paper strips, peptide...

Determinação da composição da película adquirida formada in situ sobre o esmalte e dentina humanos através de análise proteômica / Determination of the composition of the acquired pellicle formed in situ on human enamel and dentin: proteomic study

A película adquirida (PA) é um filme formado pela adsorção seletiva de proteínas, glicoproteínas e lipídeos à superfície dentária. A presença de proteínas na PA forma uma interface protetora sobre a superfície do dente, participando em todos os eventos interfaciais que ocorrem na cavidade bucal, tais como des- e remineralização, lubrificação das superfícies dos dentes, e aderência bacteriana. Com o advento da proteômica, tem havido um aumento considerável no conhecimento acerca do perfil proteico de PAs adquiridas formadas sobre o esmalte dentário, em diferentes situações, mas nenhum trabalho até o momento descreveu o perfil proteômico de PAs formadas sobre a dentina. Este estudo foi pioneiro em comparar o perfil proteico de PAs formadas in situ sobre o esmalte e a dentina, nos tempos de 10 minutos e 2 horas, utilizando análise proteômica quantitativa livre de marcadores. Os experimentos foram realizados por três dias consecutivos. Em cada dia, os 9 voluntários receberam profilaxia dentária e em seguida utilizaram um aparelho vestibular com 6 blocos de esmalte e 6 de dentina humanos por 10 minutos ou 2 horas. Após esses períodos, a PA formada era coletada com auxílio de um papel filtro de eletrodos embebido em ácido cítrico 3%. Para as análises foi realizado um pool com os papéis dos 9 voluntários de todos os dias, para cada substrato e tempo de formação. Após a extração e digestão das proteínas, a separação dos peptídeos foi realizada por nano-HPLC (nano-Cromatografia Líquida de Alta Performace), interligada a um espectrômetro de massa (nLC-ESI-MS/MS). Os dados MS/MS obtidos foram processados e pesquisados em bancos de dados de proteínas humanas (UniProt e TrEMBL), utilizando o algoritmo SEQUEST no software Proteome Discoverer 1.3. Para a PA formada sobre o esmalte, foram identificadas 160 e 64 proteínas, nos tempos de formação de 10 minutos e 2 horas, respectivamente. Os respectivos números de proteínas identificadas para a dentina foram 86 e 52...

The acquired pellicle (AP) is a film that results from selective adsorption of proteins, glicoproteins and lipids on the tooth surface. The presence of proteins in the AP forms a protective interface on the tooth surface that participates in all the surface events occurring in the oral cavity, such as de- and remineralization, lubrification of the tooth surfaces and bacterial adherence. With the advent of Proteomics, considerable increase in the knowledge of the protein profile of the AP formed on tooth enamel, under different circunstances, has been observed. However, so far the proteomic profile of the AP formed on dentin has not been described. This is the first study to compare the proteomic profile of APs formed in situ for 10 minutes and 2 hours, on enamel and dentin, using quantitative label-free proteomics. The experiments were conducted for 3 consecutive days. Each day, 9 volunteers were submitted to dental prophylaxis and in sequence wore a vestibular device containing 6 human enamel and 6 human dentin blocks for 10 minutes or 2 hours. After these periods, the PA formed was collected with an electrode filter paper soaked in 3% citric acid. The papers from the 9 volunteers, for each substrate and time of pellicle formation were pooled and used for analysis. After protein extraction and digestion, peptides were separated by nano-HPLC (High-performance liquid chromatography) coupled to a mass spectrometer (nLC-ESI- MS/MS). The obtained MS/MS spectra were searched against human protein databases (UniProt and TrEMBL) using SEQUEST algorithm in Proteome Discoverer 1.3 software. For the AP formed on enamel, 160 and 64 proteins were identified for the times of pellicle formation of 10 minutes and 2 hours, respectively. The respective numbers of identified proteins for dentin were 86 and 52, respectively. For the times of 10 minutes and 2 hours, respectively, 25 and 11 proteins were common to both substrates. They were submitted to label-free...